文章来源：中华实验眼科杂志2017年7月第35卷第7期：611-616

作者：李静文 李国文 李春霞 200080上海市中西医结合医院眼科

（李静文,现在焦作市人民医院眼科）

【摘要】背景 糖尿病视网膜病变(DR)的发病机制涉及多条通路,近年来炎症因子相关的通路学说在DR发病中的作用越来越受到人们的关注。研究表明,高糖环境下视网膜内肿瘤坏死因子-a(TNF-a)等促炎因子含量增加,从而加速视网膜中紧密连接蛋白的异常,导致血-视网膜屏障(BRB)破坏。研究发现石斛多糖可抑制TNF-a的高表达,但其在DR早期对TNF-a表达的影响尚不清楚。目的 研究石斛多糖对糖尿病大鼠TNF-a诱导的BRB通透性异常及视网膜内紧密连接蛋白1(Z0-1)、闭合蛋白( occludin)、连接蛋白5( claudin-5)表达的影响。方法 将50只清洁级成年SD大鼠分为正常对照组、糖尿病模型组及低、中、高剂量石斛多糖组,每组10只大鼠,糖尿病模型组和低、中、高剂量石斛多糖组大鼠均采用链脲佐菌素腹腔内注射法诱导糖尿病模型。低、中、高剂量石斛多糖组于建模成功后6周按照分组分别用100、200及300mg/(kg·d)石斛多糖灌胃,正常对照组和糖尿病模型组大鼠用生理盐水灌胃。干预后8周各组大鼠心脏灌注伊文思蓝并获取双侧眼球,分别进行相关指标检测,通过测定大鼠视网膜中伊文思蓝质量浓度评估大鼠视网膜渗漏量;采用 Western blot法检测大鼠视网膜内Z0-1、 occludin、claudin5蛋白的相对表达量,采用ELISA法检测大鼠视网膜中及血清中TNF-a的质量浓度。结果 正常对照组、糖尿病模型组及低、中、高石斛多糖组大鼠视网膜伊文思蓝渗漏量分别为(12.68±1,30)、(30.45±2.60)、(22.12±1.15)、(17.99±1,00)和(21.49±1.00)μg/μl,糖尿病模型组大鼠视网膜伊文思蓝渗漏量明显高于正常对照组,低、中、高石斛多糖组视网膜伊文思蓝渗漏量明显低于糖尿病模型组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。 Western blot检测显示,糖尿病模型组大鼠视网膜中TNF-a蛋白相对表达量为1.12±0.10,明显高于正常对照组的0.27±0.03,低、中、高石斛多糖组视网膜中TNF-α蛋白表达量明显低于糖尿病模型组,Z0-1、 occludin和 claudin-5蛋白表达量明显高于糖尿病模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05); 结论 石斛多糖可能通过下调糖尿病大鼠视网膜中的TNF-α的表达和上调紧密连接蛋白的表达而改善糖尿病大鼠BRB通透性的异常。

【关键词】糖尿病/并发症；血-视网膜屏障；紧密连接蛋白；肿瘤坏死因子-α；中草药；石斛多糖；SD大鼠

研究证实,糖尿病视网膜病变( diabeticretinopathy,DR)是一种慢性亚临床型炎症性疾病,早期改变以白细胞黏附、聚集及移行,血管通透性增加,血-视网膜屏障( blood- retina barrier,BRB)破坏为主要病理特征。BRB损伤是早期DR的重要病理基础2),也是DR炎症性疾病的主要表现之一。BRB正常组织结构和功能的维持与内皮细胞之间的紧密连接关系密切。参与形成紧密连接复合体的蛋白质包括连接蛋白-5( claudin-5)、闭合蛋白( occludin)多种跨膜蛋白及闭锁小、带1( zonula occludens-1,Z0-1)蛋白等膜相关蛋白类4-3)。高糖环境下视网膜内促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-a( tumor necrosis factor-a,TNF-a)和炎性因子白细胞介素-6( interleukin6,ⅡL6)含量增加,可作用于视网膜的微血管,诱导细胞间黏附分子-1表达增加,促进白细胞黏附于血管内皮细胞,甚至阻塞血管,导致毛细血管无灌注,破坏BRB6-7。研究发现,高糖环境下TNF-a的高表达与紧密连接的破坏有密切关系,抑制TNF-c表达可增加视网膜内 claudin-5、occludin、ZO-1的表达,减轻DR眼BRB的损伤。铁皮石斛是传统的中草药,其资源可再生、药理活性及低毒特性逐渐引起人们的关注。多糖是铁皮石斛中主要的药用活性成分之一,研究发现,石斛多糖在高糖环境下可抑制TNF-a的高表达,但石斛多糖是否可通过抑制TNF-a在DR视网膜中的表达而对BRB发挥保护作用尚不清楚。本研究主要探讨石斛多糖是否能降低糖尿病模型鼠视网膜内TNF-a的水平,研究石斛多糖对DR视网膜BRB通透性的影响。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物清洁级SD成年雄性大鼠50只,体质量120~160g,购自中科院上海实验动物中心,饲养于上海中医药大学实验动物中心,饲养室内温度为(22±1)℃,12h光暗循环,饲料与水消毒后自由摄取,适应性饲养1周后禁食不禁水12h。实验严格按照国家和上海市中医药大学动物中心动物使用管理条例进行。

1.1.2主要试剂石斛多糖褐色粉末(长沙中仁生物有限公司),经上海中医药大学药理实验室检测多糖含量为50%。使用前用生理盐水溶解,质量浓度分别为25、50和75mg/ml。链脲佐菌素(美国 Sigma公司);血糖仪及试纸(美国强生公司);兔抗鼠单克隆TNF-a抗体(abl85795,1:500)、兔抗鼠 occludin单克隆抗体(ab167161,1:1000)(英国 Abcam公司);兔抗鼠 claudin-5单克隆抗体(GTX37283,1:1000)(美国Gene Tex公司);鼠抗人ZO-1抗体(ab96594;1:1000)(美国 Santa cruz公司);大鼠TNF- C ellsa试剂盒(上海欣博盛生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1实验动物分组及处理应用随机数字表法将50只大鼠分为正常对照组、糖尿病模型组、低剂量石斛多糖组、中剂量石斛多糖组、高剂量石斛多糖组,每组10只大鼠,低、中、高剂量石斛多糖剂量分别为100、200和300mg/(kg·d)。中剂量石斛多糖组给药量依据2010版《药典》中人的用量6~12g/d,取10g计算。用新配制的链脲佐菌素溶液(冰浴条件下用pH值为4.2的柠檬酸钠缓冲液新鲜配成质量分数1%的溶液,按照55mg/kg的剂量行大鼠腹腔内注射,其他10只大鼠行等容量柠檬酸钠缓冲液腹腔内注射作为正常对照组。大鼠注射后72h收集尾静脉测血糖,血糖水平≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠造模成功。造模失败者及时补充大鼠。于造模成功后6周低、中、高剂量石斛多糖组分别用100mg/kg(25mg/ml)、200mg/kg(50mg/ml)、300mg/kg(75mg/ml)石斛多糖灌胃。正常对照组和糖尿病模型组采用生理盐水灌胃。

1.2.2视网膜中伊文思蓝测定视网膜血管渗漏量药物灌胃后8周于大鼠尾静脉注射伊文思蓝(45mg/kg),待大鼠皮肤变蓝后于腹腔内注射质量分数1%戊巴比妥钠(40mg/kg)行全身麻醉,每隔30min经股动脉抽血200μl,置入抗凝管,共抽血4次。离心半径为26.5cm,3000~4000r/min离心10min,取上清,检测血浆中伊文思蓝质量浓度;伊文思蓝进入血液循环后2h剪开大鼠胸腔,经左心室灌注0.5mol/L枸橼酸盐缓冲液70ml/min,持续2min以充分清除体内伊文思蓝染液,渗漏出的染液留在视网膜内。处死大鼠后取大鼠双侧眼球,一侧眼球于体积分数37%的中性甲醛溶液中固定后石蜡包埋,用于视网膜组织病理学检査;另一侧眼去除眼前节组织,解剖显微镜下钝性分离视网膜组织,并称重。用甲酞胺萃取视网膜中伊文思蓝,15000r/min离心30min,过滤,取上清,通过甲酰胺中伊文思蓝的标准曲线计算视网膜上清液伊文思蓝质量浓度。实验重复3次。

1.2.3 Western blot法测定各组大鼠视网膜内occludin、 claudin-5、Z0-1及TNF-a的表达使用强细胞裂解液提取各组视网膜总蛋白,以3:1的比例加人上样缓冲液并充分混匀,100℃水浴10min至蛋白变性。应用双辛丁酸( bicinchoninic acid,BCA)法测定各组视网膜组织总蛋白,按每孔40ug蛋白量调整上样,电泳并转膜,BSA封闭1h,添加相应一抗,4℃孵育过夜。TBST(等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液,用1mol/LHCl调整pH至7.4,用 Tween配置成缓冲液)洗后添加相应二抗,常温孵育1h,最后显影定影。采用ImaJ图像处理软件进行灰度分析,以各目的蛋白与其总蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

1.2.4 ELISA法检测大鼠血清中LL6和TNF-a含量收集各组大鼠血清,每孔100μl,设1个复孔,按照大鼠L6、TNF-a的 ELISA试剂盒说明书进行操作。取待测血清,3000~4000r/min离心10mIn,去除标本悬浮物;室温下在相应孔中加入相应浓度的标准品及标本,36℃环境下孵育90min,洗板5次;在相应孔中加入100μ生物素化抗体工作液,封闭条板孔,36℃孵育90min;洗板5次;在相应孔中加入100μl酶结合物稀释液及生物素化抗体工作液,封闭条板孔,36℃孵育90min;洗板5次;每孔加人显色底物TMB100μl,避光条件下36℃孵箱中孵育15min;各孔加入100μ终止液,用酶联免疫检测仪在波长450nm处测量各孔吸光度(A)值,获取大鼠血清中IL-6及TNF-a含量。

1.3统计学方法

采用SPSS20.0统计学软件(美国IBM公司)进行统计分析。本研究中检测指标的数据资料经Shapiro-Wlk检验符合正态分布,以x±S表示。采用完全随机分组单因素干预多水平研究设计,正常对照组、糖尿病模型组及低、中、高石斛多糖组间视网膜伊文思蓝渗漏量、视网膜和血清中TNF-含量、视网膜中TNF-a、 claudin-5、 occludin、ZO-1蛋白相对表达量的总体差异比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用ISD-t检验。采用双尾检测法,P<0.05为差异有统计学意义。claudin-5、 occludin、Z0-1蛋白相对表达量明显降低,差异均有统计学意义(t=8.013,P=0.001;t=4.853,P=0.008;t=3.92,P=0.017;t=3.85,P=0.018)。与糖尿病模型组比较,低、中、高剂量石斛多糖组大鼠视网膜TNF-α蛋白相对表达量明显降低,差异均有统计学意义(t=5.204,P=0.007;t=5.920,P=0.004;t=3.866,P=0.018);低、中、高剂量石斛多糖组大鼠视网膜 claudin-5、 occludin、Z0-1蛋白相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P<0.05);各剂量石斛多糖组间大鼠视网膜中TNF-a、 claudin-5、 occludin、Z0蛋白相对表达量的差异均无统计学意义(均P>0.05(图1,表2)。

2.3各组大鼠视网膜和血清中TNF-a含量的比较ELISA法检测结果显示,正常对照组、糖尿病模型组及低、中、高石斛多糖组大鼠视网膜及血清中TNF-a含量总体比较差异均有统计学意义(F=7.07、20.16,均P<0.01)。糖尿病模型组大鼠视网膜及血清中TNFa含量明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(t=4.74,P<0.01;t=9.12,P<0.01)。低、中、高剂量石斛多糖组大鼠视网膜中TNF-a含量较糖尿病模型组均下降,差异均有统计学意义(t=3.297,P=0.004;t=3.538,P=0.002;t=3.301,P=0.004);各剂量石斛多糖组大鼠血清中TNF-a含量较糖尿病模型组均降低,差异均有统计学意义(t=5.138,P<0.001;t=5.976,P<0.001;t=6.179,P<0.001)。各剂量石斛多糖组间视网膜和血清中TNF-a含量的差异均无统计学意义(均P>0.05)(表3)。

3讨论

研究证实,作为一种促炎因子,TNFc是已知的DR病程中炎症反应引发因子12。有研究显示,非增生性及增生性DR患者的玻璃体、视网膜及血清中TNF-a含量较正常对照组升高,且与DR的严重程度相关,且随着炎症反应的加重而逐渐升高。TNF-a可诱导白细胞募集滞留,导致血管闭塞,血流减少,血管通透性增加,并改变血管内皮细胞形态15),且TNF-a的血清水平与糖化血红蛋白及血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平具有相关性。

高糖状态下TNF-c及诱导型一氧化氮合酶在血管内皮细胞中表达增加,伴内源性一氧化氮表达增加并选择性地作用于微囊蛋白( caveolin-1)蛋白质分子位点,诱导 caveolin-1蛋白亚硝基化,并吞噬紧密连接蛋白,亚硝基化 caveolin-l蛋白诱导增加的 caveolin-1蛋白相互聚集、融合、伸展,最终形成窗孔结构,使血管通透性增加6。此外,TNF-a通过激活蛋白激酶C核转录因子KB信号途径减少紧密连接蛋白在视膜内皮细胞中的表达,使视网膜血管通透性增加。

石斛是一种中草药,具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳等功效。石斛的主要化学成分有多糖类、生物碱类、氨基酸、联苄类、菲类、倍半萜类等,其中多糖含量较高。临床常以石斛夜光丸为主方制备成加减养血活血之中药,有助于改善视力,促进视网膜出血和渗出的吸收,减轻黄斑水肿,延缓DR的发生和发展20。动物研究表明,石斛多糖可抑制TNF-α、IL-10L6和干扰素等促炎性细胞因子的表达,从而发挥抗炎作用。石斛对DR的治疗作用研究表明,石斛可降低DR组大鼠视网膜内病理性新生血管的发生,降低DR大鼠血清中TNFα、LL6、IL·1β含量;下调视网膜中TNF-a基因的表达(2)。而关于石斛多糖在DR早期的抗炎作用鲜见研究。

本研究中采用石斛多糖对糖尿病模型大鼠进行灌胃,持续8周后分别采用 Western blot法和 ELLSA法检测大鼠视网膜及血清中TNF-a蛋白表达水平,探讨DR进展过程中石斛多糖对TNF-表达的影响,结果表明石斛多糖可抑制早期视网膜中TNF-a的表达和血清中TNF-a含量,石斛多糖可上调糖尿病大鼠视网膜内上述紧密连接蛋白的表达,抑制TNF-a表达,从而对糖尿病大鼠BRB发挥保护作用。本实验结果显示,低、中、高石斛多糖的药效并未呈现明显的量效关系,高剂量可能并不会增加药物疗效,但本研究中的这种效应可能与选择的石斛多糖药物浓度梯度差距不大有关,关于石斛多糖对糖尿病大鼠BRB发挥保护作用的最小有效剂量尚有待进一步研究。目前,临床上DR早期进行抗炎治疗的方法主要有糖皮质激素、ⅤEGF抑制剂及非甾体类抗炎药的应用23,但疗效较为短暂,需要长期注射,治疗成本较高,临床依从性差,且长期局部注射易引起继发性白内障、青光眼和眼内炎等并发症(2,这些药物在早期预防DR方面的应用受到一定的限制。本研究证实,石斛多糖可降低糖尿病大鼠视网膜及血清中TNF-表达水平,上调紧密连接蛋白Z0-1、 occludin、 claudin5的表达,改善DR视网膜BRB的通透性,可为DR的早期治疗提供新的途径。