灵芝多糖对荷膀胱癌 T24 细胞小鼠 T 细胞亚群及 AQP1、AQP3 表达的影响

2018-06-16 16:31:15 发表

文章来源:中国生化药物杂志 2016 年第 12 期 总第 36 卷:33-36

文章作者:王成财1,2,梁文波1

1 大连大学附属新华医院 肿瘤科,辽宁 大连116000 ;2 锦州医科大学附属第一医院 泌尿外科,辽宁 锦州 121000)

 

[摘要] 目的 研究灵芝多糖对荷膀胱癌T24细胞小鼠T细胞亚群及AQP、AQB3表达的影响。方法选择BALB/e棵鼠30只作为实验动物,皮下注射膀胱癌T24细胞建立荷膪胱癌动物模型,随机分为对照组、顺铂组、灵芝多糖+顺铂组各10只,顺铂组给予顺铂25mg/kg腹腔注射,顺铂十灵芝多糖组小鼠给予灵芝多糖200mg/kg灌胃,顺铂25mg/kg展腔注射,对照组给予相当体积的生理盐水灌胃。测定肿瘤组织的体积和质量、外周血中T细胞亚群的含量以及肿瘤组织中AQP、AQP3、Cpse3、Bax的mNA含量结果顺铂组、顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织的体积、肿瘤组织质量明显低于对照组(P<0.05),顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织体积、肿瘤组织质量明显低于顺铂组(P<0.05);顺铂组、顺铂+灵芝多糖组CDT细胞、CD8+T细胞、D/C均明显高于对照组(P<0.05),顺铂+灵芝多糖组CDT细胞、CD/CD均明显高于顺铂组{P<0.05);顺铂组、顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织中Bax、 Caspase3的mRNA含量明显低于对照组(P<0.05),顺铂+灵芝多糖组鼠肿瘤组织Bm、Cspe3的mRNA含量明显低于顺铂组(P<0.05);顺铂组、顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织中AQP、AQB3的mRNA含量明显低于对照组(P<0.05);顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织中AQP1、AQP3的mNA含量明显低于顺铂组(P<0.05)。结论 灵芝多糖干预能够抑制荷膀胱癌T24细胞小鼠的肿瘤生长,增强细胞免疫功能,调节凋亡基因,APP1、AQB3的表达水平

[关键词] 膀胱癌;灵芝多糖;T细胞亚群;水通道蛋白;凋亡

 

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,其中超过70%为浅表性膀胱癌,多数能够通过手术切除,但是术后的复发率较高。有研究表明,浅表性膀胱癌( superficial bladder cancer,SBC)往往术后容易复发,术后需要进行膀胱灌注化疗。因此,膀胱癌术后继续进行药物辅助治疗以预防肿瘤的复发有助于改善患者的预后情况。膀胱癌的复发与免疫逃逸、细胞凋亡异常有关,选用具有免疫调节功能和促凋亡效应的药物能够预防肿瘤复发。灵芝多糖是具有抗肿瘤效应的中药材,能够通过调节免疫功能、减少血管新生来抑制肿瘤的发展。本研究分析了灵芝多糖对荷膀胱癌T24细胞小鼠T细胞亚群及AQP1、AQP表达的影响。

 

材料与方法

1材料

1.1实验动物:BAIB/′c裸鼠30只,雌性,6~8周,体重15~25g,购买于康生物科技股份有限公司(合格证号:SCXK(京)2014-005),购回后适应性饲养周,饲养条件:室温18~27℃,相对湿度40~70%。本次研究报经医院动物伦理委员会批准,同时严格遵守《实验动物管理条例》。

 

1.1.2药物与试剂:人膀胱癌细胞株T24购买于中科院上海细胞库;细胞培养用液体、消化酶购买于 Cyclone公司;灵芝多糖购买于杭州众芝康菇生物技术有限公司;CD3、CD、CD抗体购买于上海鑫乐生物科技有限公司(美国 Biolegend原装); Trizol提取液、M-MLV反转录酶购买于 Invitrogen公司,荧光定量PCR试剂购买于 Promega公司。

 

1.1.3主要实验仪器:CO2细胞培养箱(美国 TUenno公司);PCR扩增仪( Eppendorf公司);凝胶成像系统(法国VILBERLOURMAT公司);电泳仪(北京六一仪器厂);电子天平(德国 Sartorius公司);流式细胞仪( CyFlow Cube, CyFlow ploidyAnalyser)(德国 PARTEC公司)。


1.2方法

1.2.1荷膀胱癌T24细胞小鼠模型的建立:复苏膀胱癌细胞株T24,培养后进行消化和传代,取对数期生长的细胞并调节密度至1.0×103/L,将200μL肿瘤细胞悬液接种在小鼠右侧腋窝的皮下组织。待肿瘤组织生长至纵径4~5mm后表示荷瘤模型建立成功。采用随机数字表法将30只小鼠分为空白对照组、顺铂组、顺铂+灵芝多糖组各10只.

 

1.2.2药物干预方法:顺铂组给予生理盐水灌胃,1次/d连续干预18d,给予顺铂25mg/kg腹腔注射,1次/d,连续干预5d;顺铂+灵芝多糖组小鼠给予灵芝多糖200mg/kg灌胃,1次/d,连续干预18d,顺铂25mg/kg腹腔注射,1次/d,连续干预5d;照组给予相当体积的生理盐水灌胃,1次/d,连续干预18d,生理盐水腹腔注射,1次/d,连续干预5d.

 

1.2.3肿瘤体积和质量:于实验第19天在SPF实验室操作台按动物福利学将小鼠脱颈断头处死,处死小鼠后解剖得到肿瘤组织,用电子天平对肿瘤组织进行称重,用游标卡尺测量肿瘤组织的体积.

 

1.2.4外周血T淋巴细胞亚群含量:处死小鼠后取外周血组织,分别孵育CD3、Cn4、CD8的荧光抗体,缓冲液洗涤后1500r/min离心5min,PBS重悬并用流式细胞仪测定CD3、CD/CD3的比例,计算CD/CD3的比例.

 

1.2.5肿瘤组织中基因的表达量:取肿瘤组织置于匀浆器,用 Trizol法提取总RNA,反转录为cDNA后采用 Promega公司的 gPCR Master MI型进行荧光定量PCR扩增,(AQP)AQP1上游引物序列:5’ GCTCACCCGCAACTTCTCA-3,下游:5TCCTCTATTTGGGCTTCATCTC3(212bp);AQP3上游引物序列′ HGGTGGCTTCCTCACCATCAA3′,下游:5′ CGAGCCCAAAA ACAATCCCAGO3(209bp); caspase3上游引物序列:5-GACTAGCTTCTTCAGAGGCGA3’;下游:5′ ATTCCGTTGCCACCTTCCTG3'(322bp);Bax上游引物序列:F5’4 ,GCGAATT-GGAGATGAAC3’,下游:5 CCGAAGTAGGAGAGGAGG3’(307b),(94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火ls,72℃延伸lmin,共34循环;72℃延伸10min,94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸10min,共32循环;72℃继续延伸10min),反应体系为cDNA1μL、 Master mix10L、上下游引物各0.4μL、dH1208.2μL。得到扩增曲线后,以 GAPDH为内参十算目的基因水通道蛋白(AQP)AQPl、AQP、 Caspase3、Bax的mRNA含量。

 

1.3统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计学分析所有计量资料采用“x±s”表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

 

2结果

2.1肿瘤体积和质量顺铂组、顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织的体积、肿瘤组织质量明显低于对照组(P<0.05);顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织体积、肿瘤组织质量明显低于顺铂组(P<0.05)。见表1

 

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2.2外周血T细胞亚群含量顺铂组、顺铂+灵芝多糖组CD4T细胞、CDT细胞、CD’/CD3均明显高于对照组(P<0.05);顺铂+灵芝多糖组CDT细胞、CD’/CD”均明显高于顺铂组(P<0.05)。见表2及图1

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2.3肿瘤组织中Bax、 Caspase-3的mRNA顺铂组、顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织中Bax、 Caspase-3的mRNA含量明显低于对照组(P<0.05);顺铂+灵芝多糖组鼠肿瘤组织中Bax、aspase3的mRNA含量明显低于顺铂组(P<0.05)。见表3及图2。

 

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2.4肿瘤组织中AQP、AQP3的mRNA含量顺铂组、顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织中AQP1、AQP3的mRNA含量明显低于对照组(P<0.05);顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织中AQPl1、AQP3的mRNA含量明显低于顺铂组(P<0.05)。见表4及图3。

 

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3讨论

膀胱癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一,目前主要的治疗方法是手术切除,辅助以术后放疗和化疗。但是,放疗和化疗的不良反应多、患者耐受性较差,且在长期放疗和化疗过程中,会出现药物和放射线耐受的情况,影响整体治疗效果。如何通过有效的药物辅助治疗来预防膀胱癌复发是临床的重要课题。

灵芝多糖为灵芝属真菌丝体次生代谢产物,由三股单糖链构成的大分子化合物,是从灵芝孢子粉中提取的水溶性多糖成分。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分,具有广泛的药理活性,其抗肿瘤作用备受关注印。最早关于灵芝多糖的研究证实,该药物对S180肉瘤的生长具有抑制作用。近年来的研究发现,灵芝多糖能够通过抑制血管新生、调节免疫功能的途径来发挥抗肿瘤效应。本实验研究结果表明,与对照组、顺铂组比较,顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织的体积显著缩小、肿瘤组织的质量显著减轻。提示灵芝多糖能够抑制荷膀胱癌T24细胞小鼠的肿瘤生长。已有研究报道,灵芝多糖具有明确的免疫调节作用。CD细胞可协助B细胞分泌抗体和调节其他T细胞的免疫应答,CD3细胞常表现细胞毒活性,是主要的细胞毒效应细胞。本实验研究中,本文研究中,顺铂+灵芝多糖组CDT细胞、CD’/CD'均明显高于顺铂组,提示灵芝多糖能够增强荷膀胱癌T24细胞小鼠的细胞免疫功能和体液免疫功能目前关于灵芝多糖与膀胱癌细胞凋亡的关系尚缺乏研究。

Bax和 Caspase3是已知的促凋亡基因,Bax能够促进线粒体内的细胞色素C释放进入胞浆,进而激活 Caspase所介导的级联放大反应并引起细胞凋亡。我们对膀胱癌组织中促凋亡基因表达量的分析证实,与顺铂组比较,顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织中Bax、 Caspase3的mRNA含量明显降低。说明灵芝多糖干预能够下调荷膀胱癌T24细胞小鼠肿瘤组织中凋亡基因的表达。水通道蛋白(AQP)是近年来新发现的增殖相关分子,包AQP-QP12共13名成员,参与不同组织和器官水通透性的调节。已有研究报道,AQPl、AQP3高表达与膀胱癌的发生、复发密切相关。AQP主要参与肿瘤血管通透性的调节,能够促进肿瘤血管新生以及细胞增殖,同时也有利于肿瘤的迁移和侵袭[3;AQP3的主要生物学效应是促进细胞的迁移,既有利于肿瘤细胞穿过微血管屏障并向远处迁移,也能够促进内皮细胞迁移、增加新生血管形成0。本实验研究中,顺铂+灵芝多糖组小鼠肿瘤组织中AQP1、AQP3的mRNA含量明显低于对照组与顺铂组, Huang等也有类似的文献报道,提示灵芝多糖有助于下调小鼠肿瘤组织中AQPl、AQP3表达水平。

本文研究表明,灵芝多糖干预能够抑制荷膀胱癌T24细胞小鼠的肿瘤生长、增强细胞免疫功能,调节促凋亡基因、AQP1、AQP3的表达,可作为膀胱瘤化疗辅助用药,其可能作用机制还有待于更多的基础研究与临床研究去证实。