文章来源：实用口腔医学杂志，2008，24（6）:784-788

作者：张娟 高文信 王翔 魏秀峰 蔡研 王家凤

【摘要】目的:探讨灵芝三萜在口腔癌变发生发展过程中的抑制作用和机制。方法:建立金黄地鼠颊囊动态癌动物模型60只,分2组:A组(灵芝三萜组),B组(对照组),每组30只疫组化技术检测VEGF在动物模型中的表达变化,并进行统计学处理。结果:6周吋A组正常黏膜上皮例数多于B组,上皮异常增生率A组明显低于B组(P<0.01),9周时中、重度上皮异常增生和癌变率A组低于B组(P<0.05),12周时A组癌变率低于B组(P<0.01)。在整个癌变动态观察期内,2组颊囊癌变过程中不同组织学发生情况有显著差异(P<0.01),A组病变严重程度始终低于B组。VEGF表达强度随着正常黏膜至鱗癌的发展逐渐增强。在上皮单纯增生、上皮异常增生鱗癌中A组与B组相比,差异均有显著性(P<0.05)。结论:灵芝三萜对口腔黏膜癌发展过程中具有抑制作用并显现出明显的血管抑制作用。

【关键词】灵芝三萜;口腔;鳞状细胞癌;血管上皮生长因子;抗肿瘤

灵芝三萜是从灵芝中提炼出来的一类苦味化合物,具有多种药理活性。国内外学者研究表明,灵艺三萜具有抗肿瘤作用。灵芝三萜类化合物对肺癌、肝癌、结肠直肠癌等均有一定的抑制作用。本研究通过建立DMBA诱导的金黄地鼠颊囊癌变的动物模型,系统观察6周9周和12周时给予灵芝三萜组和未曾服用该药组的动物病理变化情况,应用免疫组化技术检测ⅤEGF在2组金黄地鼠颊囊癌变发生发展过程中的表达变化,探讨灵芝三萜在口腔癌变发生发展过程中的抑制作用。

1材料与方法

1.1实验动物的选择和分组

6~8周龄叙利亚金黄地鼠60只,体重80~100g,雌雄各半。随机分为2组,在干燥、空气流通、24h光暗循环条件下雌雄分笼饲养,饲以金黄地鼠专用饲料,饮用水为普通自来水。

1.1.1灵芝三萜组(A组)30只,常规饲养2周后,每日上午禁食4h,按100mg/kg剂量灌胃喂服10g/L灵芝三萜羧甲基纤维素钠溶液Iml。双侧颊囊涂布0.5%(5g/L)的二甲基苯丙蒽( dimethy lbenzanthra-cene,DMBA)丙酮液,每周一、三、五涂布。涂布期间分6、9、12周各处死10只,可得双侧颊囊标本。

1.1.2对照组(B组)30只,常规饲养2周后,喂服1ml0.5%羧甲基纤维素钠溶液,其余处理同上。

1.2试剂

甲基苯丙蒽(9,10 dimethyl-1,2 benzanthracene,DMBA)( Sigma公司)。丙酮液分析纯(长春医药器材公司)。灵芝三萜(吉林大学超硬材料实验室杨海滨老帅惠赠)。SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),ⅤEGF多克降抗体(武汉博士德生物工程有限公司),浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3方法

1.3.1组织学检查取动物颊囊黏膜病变组织约1,0cmx1.0cm大小,4%多聚甲醛固定,常规脱水、包埋、切片并作HE染色。

1.3.2免疫组化染色根据SP试剂盒说明进行。以PBS代替抗体作为空白对照,以已知人血管瘤阳性片作为阳性对照。

1.4结果判定

1.4.1病理评价标准 根据WHO口腔癌前病变协作中心12项诊断标准进行分级诊断。双人复核,比较各组病损的组织学严重程度。

1.4.2免疫组化染色标准 采用半定量法进行染色强度的评价,选择无折叠、无边缘效应的典型部位,在高倍镜下(×400)随机选取10个视野,每个视野计数100个细胞,并记录阳性细胞数,计算平均百分率。VEGF阳性染色为细胞质有浅至深棕黄色颗粒着色。按下列标准分为-到+3级:<10%为-,10%~50%为+,>50%为艹。分析时-归为阴性表达,+、廿均归为阳性表达。

1.5统计处理

病理结果采用两样本率比较的x2检验。免疫组化染色结果主要采用成组设计两样本比较的秩和检验( Wilcoxon-Mann- Whitney的U检验法),检验标准取双侧a=0.05。

2结果

2.1病理观察结果

由表1可以看出,6周时A组正常黏膜上皮例数多于B组,上皮异常增生率A组明显低于B组(x2检验,P<0.01);9周时中重度上皮异常增生和癌变率A纠低于B组(x2检验,P<0.05);12周时A组癌变率明显低于B组(检验,P<0.01)。表2是2组颊囊癌变过程中不同组织学发生情况统计。经秩和检验,2组有显著差异(P<0.01)。

2.2免疫组化染色结果

VECF阳性反应产物出现于胞质。VEGF在正常口腔黏膜中不表达或为弱表达,在基底层细胞的胞质可见阳性表达,上皮下结缔组织中个别血管内皮细胞偶见阳性反应。口腔鳞状细胞癌中阳性反应多见,位于肿瘤细胞胞质,且多为强表达。肿瘤间质中,血管内皮细胞阳性反应增多,部分炎细胞也呈阳性反应。VEGF表达强度在A、B2组中均呈现出随着正常黏膜至鱗癌的发展逐渐增强。A、B2组中正常黏膜染色均为阴性。经统计分析,A组中正常组与上皮单纯增生组表达无差异(P>0.05),与上皮异常增生组、鳞癌组差异非常显著(P<0.01)。b组中正常组与上皮单纯增生组表达无差异(p>0.05),与上皮异常增生组、鳞癌组差异非常显著(P<0.05)。A组上皮单纯增生组与上皮异常增生组、鳞癌组差异均有显著性(P<0.01)。B组上皮单纯增生组与上皮异常增生组、鳞癌组差异有显著性(分别为P<0.05,P<0.01)。a、b2组中上皮异常增生组与鱗癌组表达无明显差异(p>0.05)。A组与B组相同病损相比,在上皮单纯增生、上皮异常增生、鳞癌中均有显著差异(P<0．05)(表 3、4，图1～8)。

3 讨论

口腔鳞状细胞癌( oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔中最常见的恶性肿瘤。口腔白斑(oral leukoplakia,OK)是最常见的癌前病变,癌变率为6.88%。平均癌变年龄为59.13岁,平均癌变时间为42年4。从正常口腔黏膜到OLK再到OSCC是一个较漫长的发展过程,使用天然的或合成的化学药物治疗口腔癌前病变,或阻断甚至逆转癌症的发生发展,是目前降低癌症发生率的手段之一。

本研究结果显示,在整个癌变动态观察期内,2组不同组织学发生情况差异非常显著,A组病变严重程度始终低于B组,所诱导的癌的恶性度亦低于B组,证实灵芝三萜对口腔黏膜癌具有抑制作用。VEGF表达强度在A、B2组中均呈现出随着正常黏膜至鳞癌的发展逐渐增强。A组与B组相同病损相比,在上皮单纯增生、上皮异常增生、鳞癌中均有显著差异。这说明相同病损中A组血管增生较B组弱,从而说明了灵芝三萜具有抑制血管增生的作用。

血管生成对肿瘤的生长和转移起着重要作用,是癌变发生的重要条件。许多研究表明VEGF在肿瘤血管发生中是最有效的生长因子,不受控制的血管发生在肿瘤生长和转移方面起支配作用。在一些病理情况下,如在炎症和肿瘤时,可出现VEGF的过量表达,它在许多肿瘤新生血管形成中起关键作用,并与肿瘤的侵袭、转移有关。我们研究结果显示在癌前病变及癌变期内均存在血管生成现象,并随病变恶性程度增加,血管异常生成明显增加。这与赵媛等在实验中证实的在异常增生向原位癌发展时VEGF表达有质的差异的结果一致。在口腔鳞癌中ⅤEGF表达增加与微血管密度和肿瘤恶性度有关。Wong等认为最高微血管密度和ⅤEGF的免疫反应性可以辅助基础诊断作区分口腔鱗状细胞癌亚型的依据,并指出血管生成抑制治疗可能在减少局部转移上起作用。体内外实验证实缺氧状态下在口腔癌细胞系中VEGF生成呈时间依赖性增量调节。在口腔癌缺氧的存在可能与VEGF增量调节部分有关。我们推测:灵芝三萜通过善全身和局部组织的血液循环,增加组织的血供和营养改善局部缺氧状况,阻止血管生成开关的启动阻断或者延迟癌前病变的恶性转变.

近年来对中医中药的开发利用备受关注,已有许多中药用于癌症的辅助治疗。目前对灵芝三萜的研究大多集中在肺癌肝癌等细胞系上,目前还没有关于其对口腔癌是否具有抑制作用的研究,也未曾见其用于口腔鳞癌作为辅助治疗药物的报道。本研究证实了灵芝三萜类化合物对口腔黏膜鳞癌的抑制作用,为口腔鱗癌的治疗提供了一个新的思路。但灵芝三萜的抗肿瘤作用机制比较复杂,有待于我们进一步探讨研究。