灵芝三萜对T淋巴细胞的活化作用

2018-05-25 09:39:37 发表

文章来源:中药新药与临床药理2007年7月第18卷第4期

作者:洪介民,黎庆梅(广州市红十字会医院,暨南大学医学院第四附属医院,广州510220)

摘要:目的 探讨灵芝三萜对人淋巴细胞活化时CD69HLA—DR表达的影响。方法 淋巴细胞与不同浓度的灵芝三萜分别培养6 h72 h后,用流式细胞术测定四色荧光标记抗体,分析T淋巴细胞的活化。结果 灵芝三萜对T淋巴细胞的CD69表达有促进作用,以10μgmL的浓度对CD3CD4亚群上CD69的表达最明显(P<0.05)10μgmL20 μgmL两个浓度促进T细胞表达HLA—DR(P<0.05),对CD3CD4亚群上HLA— DR表达促进更显著(P<001);同时灵芝三萜对T淋巴细胞亚群的比例无显著影响。结论 适当浓度的灵芝三萜能促进人T淋巴细胞的活化,主要是促进CD3CD4亚群的活化,对HLA—DR表达的作用超过对CD69的 作用,而对细胞亚群的比例无影响。

关键词:灵芝三萜;T淋巴细胞;CD69HLA—DR

 

灵芝含有多糖、三萜和蛋白质等多种化合物, 其中多数药理活性与灵芝三萜(Ganoderma Triter— peneGT)和灵芝多糖有关。已有研究显示,灵芝及其多种成分具有调节免疫功能的作用,抑制IL2的生成等。本文用流式细胞术检测淋巴细胞表面的CD69HLA—DR表达,观察了灵芝三萜对人淋巴细胞活化的影响。

 

材料与方法

11药物与试剂

灵芝三萜由日本第一药产株式会社研制提取,广州中医药大学李杰芬教授惠赠。荧光标记单抗CD4FITCCD8PECD3PerCPHLA—DR—APC,为BD公司产品;CD69APC由 联科公司生产。PRMll640培养液、新生牛血清为 Gibco公司产品。

12药物处理用

0.1 molL NaOH 10 mL溶解40 mg灵芝三萜,0.1 mmo|L HCl调整pH值至7.2,培养液稀释。在淋巴细胞培养体系中加入不同浓度的灵芝三萜溶液,使终浓度分别为5102050μgmL

13淋巴细胞培养与检测

由义务献血员知情同意提供,取10 mL外周血,EDTA抗凝。对照组的细胞标记CD69HLA—DR进行全血测定。灵芝三萜与全 血培养6 h,进行CD69表达的测定。淋巴细胞分离 后,调整细胞浓度至1X 10 6mL,用含10%新生牛血清和双抗的PRMll640培养液进行培养,与不同浓度的药物在375CO2、饱和湿度的条件下培养72 h以后,测定细胞表面HLA—DR的表达。

14流式细胞仪测定

仪器为BD公司CaliburFACS 型。全血测定在血液与荧光抗体混合避光孵育15 min 后,溶血12 min上机测定。培养的细胞72 h后收集,离心后去上清,取细胞沉淀约100 μL,加荧光标记的抗体,振荡混匀,室温避光孵育15 min 后上机,四色荧光测定。每一样本收集10000个细胞,以CD3和侧向散射角(SSC)设门,用CELLQUEST软件进行结果分析。

15数据统计

CD3细胞为T淋巴细胞,计算表达CD69HLA—DR的细胞在全体T细胞中表达的百分率。用SPSSl2.0软件进行配对t检验。

 

结果

21灵芝三萜对T淋巴细胞CD69表达的影响

灵芝三萜对T淋巴细胞的CD69表达有促进作用,各实验组的表达水平均有提高,但以10μgmL的浓度对CD3CD4这一亚群的作用最显著,见表1。流式分析图显示,在灵芝三萜作用下T淋巴细胞表达CD69增加,但主要增加在CD3CD4的亚群,在CD3CD8的亚群增加不显著,见图1

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22灵芝三萜对T淋巴细胞HLA—DR表达的影响

灵芝三萜对T淋巴细胞HLA—DR的表达与灵芝三萜作用浓度相关,也与T淋巴细胞的亚群有关。1020μgmL灵芝三萜对CD3细胞表达HLA—DR作用明显,进一步分析显示,HLA—DR表达的提高主要体现在CD3CD4亚群,而对CD3CD8亚群的作用不明显;在72 h的作用以后,灵芝三萜对淋巴细胞亚群的比例仍然没有明显影响,见表2。流式分析图显示,HLA—DRT淋巴细胞的表达增加对亚群比例结构没有影响,见图1

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3讨论

淋巴细胞发挥免疫功能均经历活化的过程,在活化过程中的初期表达CD69,后期则表达HLA— DR。选择CD69HLA—DR作为对淋巴细胞免疫状态的观察指标,即使细胞未至增殖与分泌细胞因子的阶段细胞也可以进行观察,因此具有较好的客观性和敏感性。有研究结果表明,灵芝水煎剂有较强的胸腺增殖和升高白细胞的作用,对细胞免疫有较强的增进作用,而巨噬细胞吞噬功能和体液免疫需更高浓度。王斌等人报道,40200μgmL的灵芝三萜均可刺激小鼠脾脏树突状细胞增殖,但其刺激强度均明显低于细胞因子组;灵芝三萜与细胞因子共同作用,促增殖作用又明显高于细胞因子组。认为灵芝三萜能直接促进小鼠脾脏的增殖,而且与细胞因子有显著的协同作用。郭春沅报道灵芝表现出双向免疫调节功能,对于静止的T细胞或为亚适剂量的刀豆蛋白A(ConA)轻度激活的细胞,一方面灵芝对ConA起增强作用,促进淋巴细胞增殖;另一方面若T细胞受适量ConA刺激而呈高度激活状态时,灵芝对淋巴细胞的增殖起抑制作用。

按照通常的体外药理实验的剂量,200μgmL的 灵芝三萜浓度偏高,因此我们观察了550μgmL的灵芝三萜的作用。结果显示,灵芝三萜的作用并不与作用浓度成比例,高浓度的作用并不明显。本研究未能揭示其中的机理,有待进一步的研究。

本研究表明,适当浓度的灵芝三萜能促进淋巴细胞的活化,对后期活化的作用超过对初期活化的作 用。对于T淋巴细胞的CD3CD4CD3CD8两个亚群,灵芝三萜对CD3CD8亚群的活化没显著的作用。灵芝三萜主要是促使CD3CD4亚群细胞表达CD69HLA—DR,来促进T淋巴细胞(CD3细胞)的活化。淋巴细胞亚群之间的比例是常用的细胞免疫观察指标,在培养6 h72 h后,灵芝三萜对淋巴细胞亚群之间的比例没有影响。

我们选择健康献血员的淋巴细胞作为研究对象,检测数据有较大的离散度,特别是CD69结果的变化更为明显,这可能与献血员的免疫状态有关。CD69 作为早期T细胞活化的标记,容易受到外界对免疫系统的干扰而呈现短暂的变化;同时推测是灵芝三萜纯度欠佳也增加了结果的变化。因此,灵芝对免疫功能影响的深人研究需要多指标的综合分析,也需要提高灵芝成分提取的质量控制。同时作为人体的研究,需要更大的研究样本和随访观察。